시스틴 및 티로신을 첨가하여 CHO 해외 스포츠해외 스포츠 개선 된 항체 생산성 | 기술 개발 및 혁신

AGC 연구 보고서 74 (2024)

1성능 화학 물질

시스틴 및 티로신을 추가하여 CHO 세포에서 개선 된 항체 생산성

시스틴 및 티로신을 첨가하여 CHO 세포에서 항체 생산의 개선

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*AGC Corporation Advanced Infrastructure Research Institute (yusukeshibafuji@agccom)

중국 햄스터 난소 (Cho) 세포를 사용하여 항체 생산 공정을 개발할 때, 아미노산 농도의 적절한 제어가 중요한 점입니다 배양 기간 동안 높은 농도의 세포 독성을 나타내는 시스테인 (Cys) 및 티로신 (Tyr)과 같은 아미노산을 엄격하게 제어하는 것은 쉽지 않으며, 세포질 망막 스트레스 (ER) 스트레스와 같은 세포 내 인자의 세포 내 메커니즘을 이해 한 후 공정 매개 변수를 최적화해야한다

이 연구에서, Cys보다 독성이 적고 세포 내 메커니즘에서 더 일반적으로 사용되는 시스틴 및 Tyr의 첨가 효과를 설명하기 위해 다중 분석 (전 사체 및 프로테옴)을 수행하기 위해 수행되었다 결과는 시스 스틴의 첨가가 ER 스트레스 및 ER- 관련 분해 (ERAD) 및 아 pop 토 시스의 촉진으로 인한 생존 및 생산성을 감소 시킨다는 것을 보여 주었다 다른 한편으로, Tyr의 첨가는 ER 스트레스 및 아 pop 토 시스를 억제 한 것으로 확인되었으며,이 효과는 Tyr로부터 생합적으로 유비 퀴논 (Coenzyme Q10)에 의해 야기되었음을 시사한다 시스틴 첨가에 의해 야기 된 프로 아 opt 토 시스 효과를 억제하기 위해, Tyr 및 시스틴은 동시에 첨가되었고, GSH 대사의 활성화, ER의 억제 및 산화 스트레스 억제, ERAD 감소 및 시트르 산 사이클 (TCA 사이클)의 활성화 (TCA 사이클)와 같은 변화가 확인되어 세포 분비 및 생존율을 향상시켰다 또한, 경로 분석은 DNA 복구 안정화, 세포 분열 촉진 및 산화 인산화의 활성화와 관련된 경로가 항체 생산에 중요하다는 것을 시사한다 이 연구에 제시된 다중 생물 접근법은 동물 세포뿐만 아니라 광범위한 세포에도 적용될 것으로 예상되며, 미래 양식을 포함한 다양한 바이오 프로세스의 개선으로 이어질 것으로 생각된다

　시스틴 및 티로신을 첨가하여 CHO 세포에서 항체 생산의 개선

모노클로 날 항체 (MAB) 생산 공정의 경우, 아미노산의 농도를 제어하는 것이 중요하다 특히, 시스테인 (Cys) 및 티로신 (Tyr)은 독성 및 낮은 용해도로 인해 배양 과정에서 조절하기가 어렵다 높은 생산성을 달성하기 위해, Cys 및 Tyr와 관련된 소포체 (ER) 스트레스 및 산화 스트레스와 같은 억제 사건의 세포 내 메커니즘은 설명 된 것으로 간주되어야한다 이 연구에서, 우리는 세포 독성이 적은 Cys의 전구체 인 Tyr 및 시스틴을 첨가하는 조건을 비교하기 위해 다중 생물 분석 (전 사체 및 프로테옴)을 수행했습니다 시스틴의 첨가는 ER 스트레스 증가, ER- 관련 분해 (ERAD)의 촉진 및 아 pop 토 시스로 인해 생존력과 생산성을 감소시켰다 반대로, Tyr의 첨가는 ER 스트레스 및 아 pop 토 시스를 억제 하였다 우리는이 효과가 Tyr로부터 생합적으로 유비 퀴논 (Coenzyme Q10)의 양이 증가했기 때문이라고 생각했다 시스틴의 첨가에 의해 야기 된 아 pop 토 시스를 억제하기 위해, Tyr를 시스틴에 간단히 첨가 하였다 이러한 조건은 글루타티온 대사의 활성화, ER 스트레스 억제 및 산화 스트레스 억제, ERAD의 감소 및 트리카르 보닐 산 사이클의 활성화로 인해 성장, 생존력 및 MAB 생산성을 향상시켰다 Innuity Pathway Analysis의 결과는 DNA 복구 안정화, 세포 분열 촉진 및 산화 적 인산화 활성화와 관련된 경로가 MAB 생산에 중요하다는 것을 시사한다 이 연구에 제시된 다중 생물 접근법은 바이오 프로세스를 향상시킬 것입니다

1 소개

바이오 제약은 최근 몇 년 동안 주목을 끌고 있으며 항체 약물의 발달은 특히 표적 분자에 대한 높은 특이성으로 인해 적극적으로 진행되고 있습니다⁽¹⁾항체 생산에 대한 수요가 증가함에 따라 많은 회사들이 생산 공정을 개선하는 데 중점을두고 있습니다 CHO 세포는 항체 생산에 일반적으로 사용되며, 배양 배지 및 배양 방법을 최적화함으로써, 젖산과 암모니아의 축적을 방지하면서 필수 영양소의 고갈을 방지하기 위해 공정 설계가 이루어졌다⁽²⁾이러한 연구의 대부분은 한 요인의 영향에 중점을두고 있으며, 아미노산과 같은 필수 성분의 상호 작용에 대한 연구는 여전히 제한적입니다 또한, 더 높은 생산성을 달성하기 위해서는 세포에서 ER 스트레스 및 산화 스트레스와 같은 억제제로 알려진 세포 내 메커니즘을 명확히해야하지만 연구는 여전히 불충분하다

CHO 세포에 의한 항체 생산에서 높은 항체 생산성을 달성하는 데 중요한 아미노산 농도의 엄격한 제어가 필수적이라는 것이 인식되었다 그러나, 가용성이 낮은 세포 독성 및 티로신 (Tyr)을 나타내는 시스테인 (Cys)과 같은 아미노산을 제어하는 것은 첨가제 용액 및 심각한 농도 조절의 조정이 어려워서 도전이다^(3,4)

Cys는 필수 아미노산이 아니지만 세포에 필수적이며 성장, 생존 및 생산성 유지에 영향을 미치는 것으로보고되었습니다^(3,5)그러나, 845의 PKA를 갖는 Cys의 티올은 생리 학적 조건 하에서 상대적으로 쉽게 분리하고 (pH 74) 티올 레이트 음이온을 생성하여 고도로 세포 독성을 만들고 일반적으로 CYS 농도를 중간 정도의 낮게 유지한다⁽⁶⁾반면에, 시스틴에서, 티올 그룹은 이황화 결합을 형성하므로 해리가 발생하지 않습니다 또한, 시스틴/글루타메이트 수송 체에 의해 세포로 쉽게 운송되기 때문에⁽⁷⁾, 세포에 대한 안전한 공급원

Cys는 글루타티온 (GSH) 합성에 대한 속도 제한 기질이며, Cys의 고갈은 세포 내 GSH의 고갈을 유발한다 GSH는 트립 펩티드 (γ-L- 글루타밀 -L- 시스테 닐 글리신)이며, 세포 내에서의 활성 산소 해독 및 세포질 회고리에서 이황화 결합 형성의 조절과 같은 세포 내에서 ER 및 산화 스트레스를 감소시키는 효과와 밀접한 관련이있다^(8-10)

항체에는 많은 이황화 결합이 있기 때문에,이 결합의 형성은 항체 생산에 대한 속도 제한이다 이황화 결합의 형성을 위해, 단백질 이황화 이소 머라 제 (PDI)가 필요하며, 이는 초기 폴리펩티드 사슬의 Cys와 전자를 교환하여 산화성 폴딩을 촉진시킨다 이 공정 동안 감소 된 PDI는 재산 화되고 과산화수소 (H₂1지속 가능성₂) 생성 시간₂1지속 가능성₂GSH에 의해 줄어 듭니다 이런 이유로 GSH는 H₂1지속 가능성₂해독에 중요하며 GSH 고갈은 산화 스트레스로 인한 ER 스트레스를 유발합니다^(3,5,11)따라서, 세포 내 CYS 농도의 감소는 GSH 관련 세포 스트레스를 유발하고 항체 생산성을 감소 시킨다고 생각된다⁽¹²⁾, 그 메커니즘의 세부 사항은 여전히 잘 알려져 있지 않습니다

TYR은 특정 생산성 (QP) 및 TYR 서열 돌연변이를 피하는 데 관여하는 것으로 밝혀졌으며, 배양 동안 Tyr 농도의 감소는 살아있는 세포 밀도 (VCD)의 감소 및 생존율의 감소를 유발한다^(13,14)Tyr 농도의 감소는자가 포식 세포 사멸로 인한 리소좀 산성화 및 세포 용해를 초래할 수 있다고 제안되었다⁽⁴⁾세포 스트레스의 관계와 상세한 메커니즘과 Tyr 고갈로 인한 배양 경향의 변화는 아직 명확하지 않았다 또한, 벤조 퀴논의 퀴 노이드 핵 인 코엔자임 Q10은 박테리아 및 진핵 생물 미생물의 시미 메이트 경로로부터 유래되며, 포유 동물의 필수 아미노산 인 Tyr로부터 합성되며 산화 스트레스 효과를 갖는 것으로 알려져있다⁽¹⁵⁾그러나, 세포에서 Tyr로부터 유래 된 이러한 생합성 분자의 효과에 대한 세부 사항은 알려져 있지 않다

이 연구는 다중 생물 분석을 사용하여 시스틴 및 TYR의 첨가와 관련된 ER 스트레스, 산화 스트레스, TCA 사이클 활성,자가 포식 및 아 pop 토 시스와 관련된 항체 생산 억제제를 식별하고, 세포에 대한 시스틴 및 TYR의 효과를 명확하게하는 것을 목표로했다

2 실험 방법

21 OMICS 분석을위한 Fed Batch Culture

세포를 숙주 세포로서 혈청이없는 쉐이킹 배양에 적응 된 DG44 CHO 세포를 사용하여 항체 발현 벡터 (사내 개발)로 형질 감염시켰다 생성 된 형질 감염제 풀은 단일 세포 클로닝하여 클론을 얻었다 수득 된 항체 생산 클론을 사용하여 Fed-Batch 배양을 수행하고 OMICS 분석을 위해 샘플링 하였다

Fed-Batch 배양 물을 125ml Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 Shaker 인큐베이터에서 수행 하였다 배양 물은 370 ° C, 125 rpm (직경 25mm), 5% CO₂조건에서 수행되었습니다 각 조건 각각 30mL의 시작 부피에서 독점적 화학적으로 정의 된 기저 배지를 사용하여 3 개의 생물학적 복제물을 수행 하였다 살아있는 세포 밀도 05 x 10⁶26528_26672표 1에 표시된 금액 추가되었습니다

22 코엔자임 Q10

상기 언급 된 것과 동일한 IgG- 발현 클론을 사용하여 배치 배양을 수행 하였다 배양은 125ml Erlenmeyer 플라스크를 사용하여 Shaker 인큐베이터에서 수행되었다 L- 글루타민, 인슐린 및 플루로 닉을 함유하는 배지를 기저 배지에서 CDDG44 배지 (Thermo Fisher : Catalog Number : 12610010)로 사용 하였다 배양의 시작 부피는 25 mL 였고, 각 배양 조건 (3 개의 생물학적 복제) 하에서 3 회 배양 물을 수행 하였다 배치 문화의 시작 (0 일),표 2에 표시된 보충제 문화 7 일째에 추가 및 샘플링되었습니다

23 살아있는 세포 밀도, 생존, 생산성 및 대사 산물 측정

VCD 및 생존율 측정은 Trypan Blue 배제 방법을 사용하여 VI- 세포 XR 세포 생존력 분석기 (Beckman Coulter)를 사용하여 측정되었다 배양 배지 (9391 g x 1 분, 4 ° C)를 원심 분리하여 세포를 제거하고 옥트 (Sartorius)를 사용하여 생산성을 측정 하였다 대사 산물은 또한 Bioprofile Flex2 (Nava Biomedical)를 사용하여 측정되었다

24 전 사체 및 프로테옴

각 배양 조건에 따라 3 개의 샘플링을 수행 하였다 샘플링 된 배양을 원심 분리 (14000 g x 30 초 x 2 ° C)에 의해 세포로 분리하고 상청액을 제거 하였다 나머지 세포 펠렛을 2 mL의 빙냉 PBS로 세척 한 다음 다시 원심 분리하여 (14000 g x 30 sec x 2 ° C) PBS를 제거하고, 생성 된 세포 펠렛 샘플을 분석까지 -80 ℃에서 동결시켰다

전 사체 시퀀싱은 Azenta Life Sciences (Chelmsford, MA, 미국)에서 수행되었다 세포 펠렛으로부터 총 RNA를 추출하고 mRNA를 폴리 A 선택에 의해 농축시켰다 라이브러리는 mRNA에 기초하여 제조되었고, 시퀀싱은 일루미나 NG에 의해 쌍 엔드 모드로 수행되었다

RNA-Seq 데이터는 FASTP 버전 0210⁽¹⁷⁾, 스타 버전 276a⁽¹⁸⁾게놈 DNA 서열 (Cricetulus griseus chok1gs, ensembl release 104, 가입 번호 GCA_9001860951)을 동화시키는 데 사용되었습니다 RSEM 버전 133⁽¹⁹⁾를 사용하여 전 사체 계산을 수행 하였다 발현-변수 유전자의 검출은 Edger 버전 3381⁽²⁰⁾를 사용하여 수행되었습니다

Thermo Scientific Easy-NLC1200 (Thermo Fisher Scientific) 및 Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid Mass Spectrometer (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 프로테옴 측정을 수행 하였다

LC/MS를 사용하여 얻은 데이터는 스캐 폴드 DIA 버전 310 (Proteome Software, Oregon, 미국)을 사용하여 분석되었습니다 스펙트럼 라이브러리는 alesembl (C griseus chok1gs, ensembl release 104)에서 얻은 아미노산 서열을 사용하며 스캐 폴드 dia 및 prosit⁽²¹⁾를 사용하여 생성되었습니다

경로 분석은 Ingenuity Pathway Analysis Software (IPA, Qiagen)를 사용하여 수행되었습니다

3 실험 결과

31 시스틴 첨가 효과 (C : T = 1 : 0 및 C : T = 0 : 0)

Fed-Batch 배양 및 OMICS 분석을 수행하여 시스틴을 첨가하는 조건 (C : T = 1 : 0)과 첨가제를 추가하기위한 조건 (C : T = 0 : 0)을 비교 하였다 Cystine이 추가되는지 여부에 대한 배양 경향 데이터 및 Omics 분석 결과그림 1에 표시됩니다

이전 연구와 달리^(3,5)시스틴의 첨가는 문화의 후반부에서 생존과 생산성을 감소시키는 경향이 있음을 확인했습니다 C : T = 1 : 0 조건 하에서, 생존율은 14 일까지 유지 될 수 없었고 OMICS 분석을위한 적절한 셀 샘플은 얻을 수 없으므로 C : T = 1 : 0 조건의 경우 12 일까지 OMICS 데이터를 C : T = 0 : 0 조건과 비교 하였다

　24회사 정보(BIP, GRP-78) 및2새로운 비즈니스ER 스트레스의 마커로 알려져 있습니다^(22,23)또한, 활성화 된 전사 인자 3 유전자 (2back) ER 응력에 의한 특전의 활성화에 의해 유도되는 것으로 알려져 있습니다⁽²⁴⁾이들 ER 스트레스 마커에 대한 mRNA의 양은 시스틴의 첨가에 따라 유의하게 증가하여 시스틴의 첨가가 ER 스트레스의 원인임을 나타낸다 (그림 1 D, E, F)

ERAD 관련 인자로 알려진 전사 인자 6 유전자 (2기술 개발 시스템), UBX 도메인 함유 단백질 4 (25가치 창출의 역사2이동성 | 기술 해외 스포츠 분석 및 혁신 | AGC2전자 장치 | 기술)의 mRNA 수준을 비교 하였다 (그림 1 g, h, i) ATF6은 소포체 스트레스 반응 (UPR)과 관련이 있으며 ERAD 경로의 구성 요소로 알려져 있습니다⁽²⁵⁾25가치 창출의 역사UBXD2로도 알려져 있습니다25가치 창출의 역사유전자에 의해 암호화 된 단백질이며 ERAD를 촉진하는 ER 적분 막 단백질로 알려져 있습니다⁽²⁶⁾또한,2전자 장치 | 기술ERAD에서 잘못 접힌 소포륨 단백질의 유비퀴틴-의존적 분해에 관여하는 것으로보고되었다⁽²⁷⁾C : T = 0 : 0 조건과 비교하여, 이들 마커에 대한 mRNA의 양은 C : T = 1 : 0 조건 하에서 상당히 증가했다 이 결과는 시스틴의 첨가가 문화의 후반기 동안 공격적인 ERAD를 유발했음을 보여 주었다

또한, 아 pop 토 시스와 관련된 인자에 대한 배양 조건 사이의 비교가 이루어졌다 GADD34 (2도시의 진화와 이동성 지원) 프로 테아 좀 억제로 인한 세포 사멸을 촉진하는 것으로 밝혀졌다⁽²⁸⁾이것2도시의 진화와 이동성 지원의 mRNA 양 C : T = 1 : 0 조건 하에서 유의하게 증가했으며, 시스틴 첨가 조건 (그림 1J)

32 티로신 첨가 효과 (C : T = 0 : 3 및 C : T = 0 : 0)

이전 연구에서⁽⁴⁾TYR의 첨가는 CHO 세포의 연준 배양 배양 동안 배양 후반 및자가 포식 세포 사멸의 생존율 감소를 억제 할 수 있다고보고되었다 문화에 대한 TYR 첨가의 효과를 확인하기 위해 Fed-Batch Culture 및 Omics Analysis (그림 2)

배양 결과는 이전 연구에서와 같이 Tyr의 첨가가 생존율의 감소를 억제 할 수 있음을 보여 주었다 또한 ER 스트레스의 마커입니다24회사 정보, 2새로운 비즈니스, 2back감소하면서 Tyr (그림 2 D, E, F)

이전 연구에서 제안한 바와 같이, Tyr 첨가의자가 포식 억제 효과의 시험으로서, 우리는 C : T = 0 : 0 및 C : T = 0 : 3 조건 하에서 Tyr를 추가하여자가 포식을 억제하는 효과를 조사했다P62/SQSTM1의 표현 수준 비교되었습니다P62/SQSTM1LC3에 직접 결합하고자가 포식에 의해 효율적으로 분해함으로써자가 포식 소체에 선택적으로 포함되는 것으로 알려져있다 따라서자가 포식이 억제 될 때 축적되고자가 포식이 유도 될 때 감소합니다⁽²⁹⁾그림 2GP62/SQSTM1의 mRNA 발현 수준을 비교할 때 TYR (C : T = 0 : 3)을 추가하는 조건과 TYR (C : T = 0 : 0)을 추가하는 조건 사이에서 거의 동일합니다 이 결과는 Tyr 첨가의 유무에 따라자가 포식의 빈도에 차이가 없음을 나타냅니다 반면에,2도시의 진화와 이동성 지원Tyr 첨가 조건 하에서 감소되었다 (C : T = 0 : 3), Tyr를 첨가함으로써 아 pop 토 시스의 억제가 확인되었다 (그림 2H)

Tyr 첨가가 아 pop 토 시스를 억제하고 생존율을 유지하는 메커니즘을 확인하기 위해, 우리는 Tyr로부터 생합성 된 코엔자임 Q10에 초점을 맞추었다 코엔자임 Q10이 산화 스트레스를 줄이고 아 pop 토 시스를 억제 할 가능성을 확인하기 위해, 우리는 Tyr 첨가가없는 배치 배양 동안 코엔자임 Q10을 추가하고, TYR 첨가 조건과 유사한 결과를 얻을 수 있는지 확인했다 (그림 2 I, J) 결과적으로, 코엔자임 Q10의 첨가는 Tyr 첨가의 생산성과 동일한 수준의 생산성을 산출하고 Tyr 첨가 조건보다 생존율의 감소를 방지한다는 것이 확인되었다 이 결과는 Tyr로부터 생합성 된 코엔자임 Q10이 배양의 후반기 동안 생존율을 유지하는데 효과적이라는 가설을 뒷받침하는 것으로 보인다

33 시스틴 및 티로신의 동시 첨가 효과 (C : T = 0 : 3, C : T = 1 : 3, C : T = 3 : 3)

시스틴 첨가에 의해 야기 된 전력 감소로 인한 아 pop 토 시스를 억제하기 위해, Tyr를 시스틴과 동시에 세포에 첨가하고, 시스틴의 양 비율을 변화시켰다 동시에, 시스틴 및 Tyr (그림 3-4)

시스틴 만 첨가 된 조건 (C : T = 1 : 0 조건,그림 1)와 달리, 충분한 TYR을 동시에 추가함으로써 (C : T = 1 : 3, C : T = 3 : 3) 성장 능력이 향상되고 생존율이 유지되며 생산성이 향상되는 것으로 나타났습니다 (그림 3 A, B, C) 최종 생산성은 C : T = 0 : 3 조건에 따른 생산성을 기반으로했으며 C : T = 1 : 3 조건에서 생산성이 약 2 배, C : T = 3 : 3 조건에서 약 3 배 높았습니다 C : T = 3 : 3 조건은 또한 C : T = 1 : 3 조건에 비해 증식을 크게 향상시킨다 이러한 결과는 Tyr가 CHO 세포에서 시스틴의 소비에 필요하다는 것을 시사한다

또한 ER 응력 마커입니다24회사 정보, 2새로운 비즈니스,2back의 결과에서 (그림 3 D, E, F), C : T = 0 : 3 조건과 비교하여, ER 응력 마커에 대한 mRNA의 양은 C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3 조건 하에서 배양의 후반부에서 더 낮았다 이것은 충분한 양의 시스틴과 Tyr를 첨가하면 ER 스트레스를 억제하는 효과가 있음이 밝혀졌습니다

항체는 많은 이황화 결합을 갖는 단백질이며 복잡한 3 차원 구조를 가지며, PDI와 같은 분자 샤페론은 생산에 필수적이다그림 3 g, H의 결과 PDI의 발현 수준은 필요한 양의 시스틴 및 Tyr의 첨가에 따라 증가했음을 보여 주었다 이들 결과로부터, 세포 내의 분자 샤페론으로 올바르게 작동하고 단백질의 적절한 폴딩으로, 잘못 폴딩 단백질의 보유로 인한 UPR을 예방할 수 있고, 항체 생산성이 향상 될 수 있다고 생각된다

과산화물 디스 뮤 타제 1 및 2 (SOD1, SOD2)는 각각 세포질 및 미토콘드리아에서 과산화물 음이온 라디칼을 유발하는 덜 유해한 H₂1지속 가능성₂|, 산화 스트레스 및 세포 독성으로부터 세포를 보호하는 데 도움이되는 것으로 알려져^(30,31)SOD1 및 SOD2의 단백질 발현 수준은 C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3의 C : T = 0 : 3 조건 (그림 3 I, J) 이 결과는 산화 스트레스가 C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3 조건 하에서 올바르게 관리되었음을 보여 주었다 샤페론의 적절한 발현과 결과적으로 산화 스트레스에 대처하는 것은 풍부한 CYS로부터 발생하는 GSH 및 SOD를 통해 달성 될 수 있다고 믿어진다

다음으로, GSH 대사 관련 요인의 비교가 수행되었다 (그림 4 A, B, C3가치 창출 네이버 이 해외 스포츠 | 기술 개발 및 혁신 | AGC⁽³²⁾GSTM은 μ 패밀리로 분류 된 GST이며, GSH의 우주 분자에 대한 결합을 촉매함으로써 세포를 해독하는 것으로 알려져있다⁽³³⁾그림 4의 결과에서 C : T = 0 : 33이동성 | 기술 해외 스포츠 분석 및 혁신 | AGC의 mRNA 발현 수준이 발견되었습니다 증가했습니다 이러한 결과는 Cys 공급이없는 C : T = 0 : 3 조건에서 GSH가 CYS를 세포에 포함시키기 위해 활발하게 저하된다는 것을 시사한다 한편, 세포 내 Cys의 양은 C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3 조건에서 충분하다3이동성 | 기술 해외 스포츠 분석 및 혁신 | AGC의 발현 수준이 발견되었습니다 억제되고 GSH 분해가 억제되었다 또한,3Kokaisei Space "AO", 36창립의 정신에서 mRNA의 양 C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3 조건에서 C : T = 0 : 3 조건에서 증가했으며, 세포 내 해독 활성이 C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3 조건 하에서 활성화 된 것으로 밝혀졌다 이 결과로부터 C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3의 조건 하에서 나머지 GSH는 H₂1지속 가능성₂세포를 해독하고 세포 활성을 추가로 정규화하고 활성화시킨다

이것은 항체 생산성에 영향을 미치는 ERAD 관련 요인을 비교하기 위해 위에서 언급 한 것입니다2기술 개발 시스템, 25가치 창출의 역사, 2전자 장치 | 기술의 mRNA의 양 분석되었습니다 (그림 4 D, E, F) 이들 인자의 발현 수준은 c : t = 0 : 3 조건 하에서 상당히 높다;2기술 개발 시스템3AGC 그룹의 지속 가능성 관리2전자 장치 | 기술와 관련하여, C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3 조건의 결과에서 볼 수 있듯이 첨가 된 시스틴의 양이 증가함에 따라 ERAD 관련 인자의 발현 수준이 감소하는 것으로 밝혀졌다 이러한 결과로부터, 충분한 양의 Tyr 및 시스틴을 첨가하면 ER 스트레스 및 산화 스트레스, ERAD를 억제 할 수 있습니다

마지막으로, 우리는 세포 증식 및 생존에 영향을 미치는 TCA 회로 관련 인자 및 아 pop 토 시스 관련 요인의 비교 분석을 수행했습니다 (그림 4 g, h, i, j) TCA 사이클 활성화를위한 주요 효소는 숙시 네이트 탈수소 효소 (SDH) 및 아코 니타 제 (ACO)를 포함한다 SDH는 구연산염주기 동안 석신산을 푸마르 산으로 산화시키는 능력을 가지고 있으며, SDHA 및 SDHB는 SDH의 촉매 코어를 형성하는 2 개의 서브 유닛이다⁽³⁴⁾ACO는 TCA 사이클 동안 구연산을 이소 시트 레이트로 전환시키는 효소이며, ACO2는 미토콘드리아에서 발현되는 것으로 알려져있다 ACO의 활성은 산화 스트레스의 바이오 마커로 잘 알려져 있으며 산화 환원 상태에서 intramitochondrial 센서로서 기능하는 것으로 밝혀졌다⁽³⁵⁾그림 4 g, h, i배양 후반에서 SDHA, SDHB 및 ACO2의 발현 수준은 C : T = 1 : 3 조건 및 C : T = 3 : 3 조건에 비해 C : T = 0 : 3 조건보다 높았으며, 이는 TCA 회로가 배양 후반까지 활성화 될 수 있음을 나타냅니다 또한, 아 pop 토 시스 마커2도시의 진화와 이동성 지원의 결과에서 C : T = 0 : 3 조건과 비교하여 C : T = 1 : 3 조건 및 C : T = 3 : 3 조건,2도시의 진화와 이동성 지원의 mRNA 함량 하향 추세에 있었고, C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3 조건 하에서 아 pop 토 시스가 억제되는 것으로 밝혀졌다

OMICS 분석 결과 C : T = 0 : 3 조건과 비교하여 C : T = 1 : 3 및 C : T = 3 : 3 조건에서 세포 내 스트레스가 유사하게 억제되었음을 보여 주었지만 C : T = 1 : 3과 C : T = 3 : 3 사이의 증식과 생산성에는 차이가 있습니다 이에 대한 이유를 명확히하기 위해, 모든 전 사체 데이터에서 발현 변화 수준을 분석 하였다 (FDR <005를 갖는 유전자는 전 사체 분석으로부터 데이터로부터 추출되었다) 발현 변화를 갖는 유전자의 수는 6 일, 9 일, 12 일 및 14 일에 관찰되었다그림 5이러한 결과는 12 일이 가장 가변적 인 발현 유전자를 가졌으며, 배양 조건 사이의 세포 내 경로의 활성화 정도에서 가장 큰 차이가 있음을 보여 주었다

다음으로, 경로 분석을 수행하여 C : T = 1 : 3과 C : T = 3 : 3 사이의 경로가 무엇인지 조사하여 12 일 동안의 데이터에 대한 조건이 가장 많았으며, 이는 가장 많은 수의 발현 가변 유전자를 가졌다 확인 된 533 개의 경로 중 C : T = 1 : 3 조건에 비해 C : T = 3 : 3 조건에서 높은 z- 점수를 가진 상위 5 개의 경로테이블 3DNA 복제의 DNA 복구 및 안정화와 관련된 경로뿐만 아니라 염색체 분리와 관련된 경로 및 ATP 생산은 C : T = 3 : 3 조건 하에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌다

4 고려 사항

이 연구에서, 다중 생물 분석은 시스틴과 Tyr 첨가 및 세포 내 스트레스로 인한 배양 경향 사이의 관계를 밝혀냈다 시스틴 단독의 첨가는 문화의 후반기 동안 생존과 생산성을 감소시키는 것으로 밝혀졌으며, ER 스트레스는 원인이었다 또한, ERAD의 세포 내 활성화 및 아 pop 토 시스의 촉진이 확인되었다 Cho Fed-Batch 배양에서 시스틴 단독의 첨가는 세포 내 환원 전력이 없으며, 세포 증식 및 생산성에 악영향을 미치는 것으로 제안되었다

4해외 스포츠 토토 베트맨 해외 스포츠 토토 베트맨 | 회사 정보 | AGC⁽⁴⁾,P62/SQSTM1의 표현 수준 결과 Tyr 고갈 조건 하에서 생존율의 감소는자가 포식-유도 된 세포 사멸 때문이 아니라고 제안한다

Tyr의 억제 효과를 확인하기 위해, 본 발명자들은 Tyr로부터 생합성 화 된 코엔자임 Q10을 추가하는 실험을 수행했으며, 코엔자임 Q10은 배양 후반에서 생존율을 유지하는데 효과적이라는 것을 발견했다 다시 말해, 코엔자임 Q10은 세포 내 스트레스 및 아 pop 토 시스를 억제하는데 효과적이라고 제안되었다 유비 퀴논은 주로 미토콘드리아에서 활성화 된 것으로보고되었다⁽³⁶⁾golgi 및 er 멤브레인에 유비 퀴논이 있다는 보고서도 있습니다⁽³⁷⁾, 효소 UBIAD1은 미토콘드리아 외부에서 유비 퀴논을 생성하는 효소 인 것으로보고되었습니다⁽³⁸⁾앞으로, 우리는 코엔자임 Q10의보다 상세한 효과를 확인하기 위해서는 ER의 스트레스 완화 메커니즘을 조사해야한다고 생각합니다

반면에, Tyr 단독의 첨가는 생산성에 큰 영향을 미치지 않았다 이것은 GSH 이용률의 감소로 인한 것으로 생각되며, 세포 대사는 재조합 산소의 생성을 억제하기 위해 재조합 단백질의 생성을 감소시켰다 이 제어는 또한 단백질 인산화와 같은 이러한 유형의 단백질 학적 분석에 의해 검출되지 않은 다른 조절 메커니즘에 기인 할 수있다

다음으로, 우리는 시스틴과 동시에 TYR을 추가하고 시스틴의 양 비율이 변경된 실험을 수행했으며, 충분한 시스틴 및 Tyr를 추가함으로써 동시에 개선 된 증식 능력을 달성하고 생존율을 유지하며 생산성을 유지할 수 있음이 밝혀졌습니다 ER 스트레스의 억제 및 GSH 대사의 활성화, SOD1 및 SOD2에 의한 산화 스트레스에 대한 적절한 반응, ERAD의 감소 및 TCA주기의 활성화는 증식 및 생산성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 또한 시스틴 및 Tyr의 충분한 첨가는 PDI의 발현을 상향 조절 한 것으로 밝혀졌다 PDIA4는 CHO 세포에서 항체의 이황화 결합의 형성을 촉매함으로써 항체 생성에 영향을 미치는 것으로 알려져있다⁽³⁹⁾,이 연구에서 확인 된 PDIA4의 발현 수준의 증가는 Komatsu et al

42브랜드 문 | 회사 정보 | 해외 스포츠 토토 사이트⁽¹⁵⁾이것으로부터,그림 2 I, J산화 적 인산화의 활성화는 검증을 수행하기 위해서는 추가 연구가 필요하다

5 요약

OMICS 분석은 세포 스트레스 및 아 pop 토 시스에 시스틴 및 Tyr의 첨가 효과를 밝혀냈다 특히,이 연구는 시스틴 또는 Tyr 단독의 효과보다는 2 개의 아미노산의 상호 작용을 포함하는 복잡한 세포 메커니즘의 세부 사항을 밝혀냈다 또한, 배양 조건 사이의 비교는 시스틴 및 Tyr의 공급 비율 및 농도가 CHO 세포에 의한 항체 생산에 중요하다는 것을 밝혀냈다

이 연구의 다중 생물 분석에서 비교 된 각 요인은 바이오 프로세스 동안 응력을 모니터링 할 수있는 잠재적 마커 인 것으로 생각됩니다 이들 마커를 지표로 사용하여 배양 공정을 개발함으로써, 우리는 세포 응력 감소 접근법을 통해 Tyr로 변형되는 코엔자임 Q10과 같은 가능한 대체 첨가제를 식별 할 수 있다고 생각합니다

또한,이 연구에서 수행 된 다중 생물 분석을 사용하여 배양 공정 개발에 대한 접근법은 연준 배치 배양뿐만 아니라 관류 배양과 같은 다양한 배양 모드에도 적용되는 것으로 생각되며 광범위한 응용 분야를 갖는 것으로 생각된다 미래에 더욱 복잡해 질 것으로 예상되는 다양한 양식의 생물 약리를위한 생산 공정을 개발할 때, 우리는 배양 공정 조건의 변화에 대한 세포 내 메커니즘을 이해하는 것이 생물 프로세스 생산성과 강력한 제어를 향상시키는 데 중요하다고 생각합니다

감사의 말

우리는이 논문을 서면으로 서면으로 그의지도와 격려에 대해 도쿄 농업 기술 대학의 Yooda Masafumi 교수에게 감사를 표하고 싶습니다

참조

Walsh, Gary "Biopharmaceutical Benchmarks 2018" 자연 생명 공학 Vol 36, 12 (2018) : 1136-1145Doi : 101038/nbt4305
Jeon, Min Kyoung et al "젖산 생산을 감소시키고 디 하이드로 폴 레이트 환원 결핍 중국 햄스터 난소 세포에서 세포 성장을 개선하기위한 LDH-A 및 BCL-2의 조합 공학" 응용 미생물학 및 생명 공학 Vol 92, 4 (2011) : 779-90 doi : 101007/s00253-011-3475-0
Ali, Amr S et al "CHO 바이오 프로세스에서 세포 생존력 및 MAB 생산에 대한 시스테인 사료 수준의 영향에 대한 다중 생물 연구" 생명 공학 저널 Vol 14, 4 (2019) : E1800352 doi : 101002/bioT201800352
Tang, Hongping et al "Fed-Batch 배양에서 RCHO 세포 성능에 대한 티로신의 역할에 대한 통찰력" 응용 미생물학 및 생명 공학 Vol 103, 16 (2019) : 6483-6494 doi : 101007/s00253-019-09921-W
Zeeshan, Hafiz Maher Ali et al "소포체 스트레스 및 관련 ROS" 국제 분자 과학 저널 vol 17, 3 327 2 월 2 일, DOI : 103390/IJMS17030327
Clement, G E 및 T P Hartz "시스테인의 미세한 이온화 상수의 결정" 화학 교육 저널 vol 48, 6 (1971) : 395-7 doi : 101021/ed048p395
Koppula, Pranavi et al "암의 시스틴 수송 체 SLC7A11/XCT : 원수 검사, 영양소 의존성 및 암 요법" 단백질 및 세포 vol 12, 8 (2021) : 599-620DOI : 101007/S13238-020-00789-5
Chakravarthi, Seema 및 Neil J Bulleid "글루타티온은 비밀 경로로 들어가는 단백질 내에서 천연 이황화 결합의 형성을 조절해야합니다" 생물학 화학 저널 Vol 279, 38 (2004 : 39872-9 doi : 101074/jbcm406912200
Ribas, Vicent et al "글루타티온과 미토콘드리아" 약리학의 국경 vol 5 151 2014 년 7 월 1 일, doi : 103389/fphar201400151
Ketterer, B et al "해독에서 글루타티온의 역할" 환경 건강 관점 Vol 49 (1983) : 59-69 doi : 101289/ehp834959
Chaudhari, Namrata et al "분자 웹 : 소포체 스트레스, 감염 및 산화 스트레스" 세포 신경 과학 vol 8 213 29 7 월 29 일, 2014, doi : 103389/fncel201400213
Ali, Amr S et al "Multi-omics는 Cysteine 사료 농도의 영향을 보여주고, CHO 세포 바이오 프로세싱에서 세포 에너지 대사 및 특정 생산성에 대한 산화 환원 불균형이 나타납니다" 생명 공학 저널 Vol 15, 8 (2020) : E1900565 doi : 101002/bioT201900565
Yu, Marcella et al "높은 역가 항체 생산 공정에 대한 향상된 영양소 공급의 세포 내 효과 이해" 생명 공학 및 생물 공학 vol 108, 5 (2011) : 1078-88 doi : 101002/bit23031
Feeney, Lauren et al "재조합 단일 클론 항체를 생성하는 CHO 세포주에서 티로신 서열 변이를 제거한다" 생명 공학 및 생물 공학 vol 110, 4 (2013) : 1087-97 doi : 101002/bit24759
Meganathan, R“미생물의 유비 퀴논 생합성”FEMS 미생물학 레터 vol 203, 2 (2001) : 131-9 doi : 101111/j1574-69682001tb10831x
Shibafuji, Yusuke et al "시스틴 및 티로신 사료는 CHO 세포에서 산화 및 ER 스트레스를 감소시킵니다" 생명 공학 저널 Vol 18, 7 (2023) : E2200638 doi : 101002/biot 202200638
Chen, Shifu et al "FASTP : 초고속 올인원 FastQ Preprocessor" 생물 정보학 (영국 옥스포드) Vol 34, 17 (2018) : i884-i890 doi : 101093/bioinformatics/bty560
Dobin, Alexander et al "Star : 초고속 보편적 인 RNA-Seq Aligner" 생물 정보학 (영국 옥스포드) Vol 29, 1 (2013) : 15-21 doi : 101093/bioinformatics/bts635
Li, Bo 및 Colin N Dewey "RSEM : 기준 게놈이 있거나없는 RNA-Seq 데이터로부터의 정확한 전사 정량화" BMC 생물 정보학 vol 12 323 2011 년 8 월 4 일, doi : 101186/1471-2105-12-323
Robinson, Mark D et al "Edger : 디지털 유전자 발현 데이터의 차등 발현 분석을위한 바이오 컨덕터 패키지" 생물 정보학 (영국 옥스포드) Vol 26, 1 (2010) : 139-40 doi : 101093/bioinformatics/btp616
Gessulat, Siegfried et al "프로 시트 : 딥 러닝에 의한 펩티드 탠덤 질량 스펙트럼의 프로테옴 전체 예측" 자연 방법 Vol 16, 6 (2019) : 509-518 doi : 101038/s41592-019-0426-7
Yoshida, H et al "포유 동물 포도당 조절 단백질의 전사 유도를 담당하는 시스-작용 소포체 스트레스 반응 요소의 확인 기본 류신 지퍼 전사 인자의 관여" 생물학 화학 저널 Vol 273, 50 (1998) : 33741-9 doi : 101074/jbc2735033741
Hetz, Claudio "전개 된 단백질 반응 : ER 스트레스와 그 밖의 세포 운명 결정을 통제합니다" 자연 리뷰 분자 세포 생물학 vol 13, 2 89-102 2012 년 1 월 18 일, doi : 101038/nrm3270
Kilberg, M S et al "유전자 발현의 영양 조절 : 포유 동물 세포가 아미노산 제한에 어떻게 반응하는지" 영양 vol 25 (2005) : 59-85 doi : 101146/annurevnutr24012003132145
Hetz, Claudio et al "질병에서 전개 된 단백질 반응을 목표로합니다" 자연 리뷰 약물 발견 Vol12, 9 (2013) : 703-19 doi : 101038/nrd3976
Liang, Jing et al "Erasin (UBXD2)의 특성 : ER- 관련 단백질 분해를 촉진하는 새로운 ER 단백질" 세포 과학 저널 119, Pt 19 (2006) : 4011-24 doi : 101242/jcs03163
Sun, Shengyi et al "SEL1L은 포유 동물 소포체 관련 분해, 소포체 항상성 및 생존에 없어서는 필수적입니다" 미국 국립 과학 아카데미의 절차 vol 111, 5 (2014) : E582-91 doi : 101073/pnas1318114111
Liu, Lintao et al "GADD34는 프로 테아 좀 억제로 인한 세포 사멸을 촉진합니다" 항암 연구 vol 35, 10 (2015) : 5317-24
Bjørkøy, Geir et al "P62/SQSTM1의자가 포식 저하 모니터링" 효소학의 방법 vol 452 (2009) : 181-97 doi : 101016/s0076-6879 (08) 03612-4
Fukui, Masayuki 및 Bao Ting Zhu "세포질 SOD1이 아닌 미토콘드리아 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 SOD2는 HT22 뉴런 세포에서 글루타메이트-유도 산화 스트레스 및 세포 사멸에 대한 보호에 중요한 역할을한다" 자유 라디칼 생물학 및 의학 Vol 48, 6 (2010) : 821-30 doi : 101016/jfreeradiadbiomed200912024
Zelko, Igor N et al "슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 다중 유전자 패밀리 : Cuzn-SOD (SOD1), MN-SOD (SOD2) 및 EC-SOD (SOD3) 유전자 구조, 진화 및 발현의 비교" 자유 라디칼 생물학 및 의학 Vol 33, 3 (2002) : 337-49 doi : 101016/s0891-5849 (02) 00905-X
Paolicchi, Aldo et al "신호 메커니즘으로서 글루타티온 이화 작용" 생화학 약리학 vol 64, 5-6 (2002) : 1027-35 doi : 101016/s0006-2952 (02) 01173-5
Xiang, Zhidan et al "14 개의 글루타티온 전이 유전자를 암호화하는 3 개의 유전자좌가없는 마우스 : GSTP, GSTM 및 GSTT 패밀리에 기능을 할당하기위한 새로운 도구" 약물 대사 및 배치 : 화학 물질의 생물학적 운명 vol 42, 6 (2014) : 1074-83 doi : 101124/dmd113056481
Rutter, Jared et al "숙신 데 하이드로게나 제 - 인간 질병의 조립, 조절 및 역할" 미토콘드리아 Vol 10, 4 (2010) : 393-401 doi : 101016/jmito201003001
Lushchak, Oleh V et al "Krebs 사이클, 철 항상성, 산화 환원 신호 및 반응성 산소 종의 대사 사이의 연계의 핵심으로서 번역 후 변형" Redox Report : 자유 라디칼 연구 Vol 19, 1 (2014) : 8-15 doi : 101179/1351000213y000000073
Wang, Ying 및 Siegfried Hekimi "유비 퀴논 이해" 세포 생물학 동향 vol 26, 5 (2016) : 367-378 doi : 101016/jtcb201512007
Kalén, A et al "래트 간의 소포체-골지 시스템에서 유비 퀴논 생합성에 관여하는 효소 인 Nonaprenyl-4-Hydroxybenzoate 전달" 생물학 화학 저널 Vol 265, 2 (1990) : 1158-64
Mugoni, Vera et al "UBIAD1은 COQ10 합성에 의해 eNOS 활성을 조절하는 항산화 효소입니다" 셀 Vol 152, 3 (2013) : 504-18 doi : 101016/jcell201301013
Komatsu, Kei et al "중국 햄스터 난소 세포의 항체 생산에 대한 이황화 이소 머라 제 PDIA4의 효과" 생명 과학 및 생물 공학 저널 vol 130, 6 (2020) : 637-643 doi : 101016/jjbiosc202008001